专家论坛｜邓国宏：慢性HBV感染者病毒特异性T淋巴细胞：耗竭还是沉默

2020年06月22日

专家论坛｜邓国宏：慢性HBV感染者病毒特异性T淋巴细胞：耗竭还是沉默？
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慢性HBV感染是我国最主要的人类病毒慢性感染,波及8%左右的人口。其免疫损伤导致的慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭和肝癌发生率居高不下。我国慢性HBV感染面临的根本问题在于,大部分患者因母婴传播于婴幼儿时期感染,表现为长期的免疫耐受,病毒难以清除［1］。慢性HBV感染长达数十年的自然史依次出现免疫耐受期、免疫清除期、低复制期和HBeAg阴性肝炎活动期四个典型阶段。



免疫耐受的概念来源于机体针对自身抗原免疫应答的研究,指机体无法对特定抗原产生有效的免疫应答。该定义很好地描述了慢性HBV感染者早期高病毒载量、无明显肝损伤的现象。弄清慢性HBV感染发生免疫耐受的机制,对于临床上实现乙型肝炎功能性治愈具有重大意义。





1  慢性HBV感染针对病毒的免疫耐受源自T淋巴细胞耗竭——证据及疑惑



基于急性HBV感染者的研究发现,病毒清除过程与HBV特异性T淋巴细胞应答紧密相关［2-4］。基于急性HBV感染黑猩猩模型的研究［5］揭示了T淋巴细胞（特别是CD8 T淋巴细胞）在HBV清除及肝损伤中的核心作用。考虑到上述HBV急性感染中的发现,慢性HBV感染针对病毒的免疫耐受源自HBV特异性T淋巴细胞异常就是一个合理的推测。而HBV特异性T淋巴细胞（特别是CD8 T淋巴细胞）也是近年来慢性HBV感染研究领域的一大热点。



相对于急性HBV感染者,慢性HBV感染者HBV特异性T淋巴细胞在数量、表型及功能上都有诸多不同：首先,该类患者HBV特异性T淋巴细胞数量很少,一般需要HBV抗原体外刺激扩增之后才能稳定检测到［6］；其次,该类患者HBV特异性T淋巴细胞高表达PD-1、CTLT-4、TIM3、Bim等免疫抑制分子,而体外阻断这些抑制分子,能一定程度上恢复HBV特异性T淋巴细胞的功能［6-10］。



慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV）感染小鼠模型是研究慢性病毒感染的经典模型。基于该模型的研究结果定义了T淋巴细胞由于抗原持续刺激导致数量减少、功能下调的状态——T淋巴细胞耗竭［11］。慢性HBV感染者病毒特异性T淋巴细胞数量、表型及功能上的特性非常契合T淋巴细胞耗竭的定义。当前主流观点也认为慢性HBV感染对于病毒的免疫耐受来源于长期HBV抗原刺激导致的T淋巴细胞耗竭。然而,T淋巴细胞耗竭的假说,无法与慢性HBV感染临床上观察到的一些现象相吻合。



首先,T淋巴细胞耗竭是由于持续性抗原刺激造成的,其程度与抗原载量呈正比［12］。据此推断,处于免疫耐受期的患者由于极高病毒载量,其HBV特异性T淋巴细胞耗竭程度应该最高。然而研究［13］发现,该类患者相对于其他期患者,其HBV特异性T淋巴细胞数量并没有明显降低,且功能相对更加完整。



其次,慢性LCMV感染模型揭示CD8 T淋巴细胞耗竭是一个渐进性功能受损过程：首先受损的是介导溶胞的细胞毒作用,随之是IL-2分泌能力,然后是TNFα分泌能力,最后是IFNγ分泌能力［14］。CD4 T淋巴细胞耗竭过程中细胞因子分泌受损模式与CD8 T淋巴细胞类似［15］。由此推断,慢性HBV感染者病毒特异性CD8 T淋巴细胞如果是耗竭状态,那么其通过细胞毒作用介导肝损伤的能力应该很弱。而临床上慢性HBV感染者一旦脱离免疫耐受期,如果不利用核苷类似物抗病毒,则非常容易发生肝损伤。如果认可CD8 T淋巴细胞在肝损伤中的核心作用,那么上述现象间接提示,慢性HBV感染者中病毒特异性CD8 T淋巴细胞耗竭程度是非常有限的。



再次,对于慢性HBV感染急性发作的患者,其呈现为高病毒载量、急性肝损伤。笔者和其他学者［16-19］的研究都发现该类患者大量HBV特异性T淋巴细胞活化,部分患者随后会发生HBeAg甚至HBsAg清除。说明这些患者尽管HBV高载量,然而其T淋巴细胞介导肝损伤和病毒清除的功能是比较完整的。可以用耗竭T淋巴细胞功能恢复来解释慢性HBV感染急性发作过程中肝损伤及后续病毒清除,但该假设很难解释为何T淋巴细胞功能恢复反而伴随HBV载量短期大幅提升。



最后,临床试验结果显示,针对HBeAg阴性、HBsAg低水平的患者,经PD-1抗体治疗后HBsAg清除率不到5%［20］。而对于该类患者,聚乙二醇长效干扰素治疗可使高达30%的患者实现HBsAg清除［21］。上述结果说明,PD-1分子上调导致的T淋巴细胞耗竭并不是慢性HBV感染无法清除病毒的主要原因。





2  慢性HBV感染中病毒特异性T淋巴细胞由分化早期的T淋巴细胞主导



近年来,基于慢性LCMV感染小鼠模型发现了一群TCF1+CXCR5+PD-1+的CD8 T淋巴细胞,这群细胞显示出一定的干性,能进一步分化为耗竭的T淋巴细胞［22］。而在肿瘤患者中的研究也发现这群干细胞样的CD8 T淋巴细胞,该群细胞在抗原递呈细胞的刺激下有效进一步分化,与患者经PD-1抗体治疗后良好预后紧密相关［23］。



如果慢性HBV感染病毒特异性T淋巴细胞不是由耗竭的T淋巴细胞主导,那么该如何定义这群T淋巴细胞的功能状态？笔者深入分析了慢性HBV感染静息期、慢性HBV感染急性发作患者的HBV特异性CD4 T淋巴细胞应答,发现HBV特异性CD4 T淋巴细胞以TNFα+细胞为主,该群细胞在高炎症患者中大量活化且与患者肝损伤协同变化；而TNFα+细胞向IFNγ+细胞的分化则利于患者病毒清除,该分化过程伴随着T淋巴细胞特化转录因子T-bet、效应分子IL-21的上调［19］。有研究［24］在HBV特异性CD8 T淋巴细胞中也观察到T-bet分子下调,但将其归因于T淋巴细胞耗竭。笔者认为,慢性HBV感染者中占主导地位的TNFα+ CD4 T淋巴细胞很可能是处于早期分化、具有一定干性的T淋巴细胞,理由如下：（1）该群细胞细胞因子谱是TNFα+ IFNγ－,这与耗竭T淋巴细胞的细胞因子谱（TNFα－IFNγ+）截然相反［25］,而慢性LCMV感染小鼠模型中具有干性的TCF1+CXCR5+PD-1+的CD8 T淋巴细胞其细胞因子谱与笔者研究发现的这群细胞类似,为TNFα+ IFNγdim［22］；（2）笔者前期对ATAC-seq数据库中的CD4 T淋巴细胞数据进行了分析,发现TNFα启动子区存在转录因子TCF-1特异结合元件,而TCF-1是维持血液细胞（包括T淋巴细胞）干性的关键转录因子［26-27］；（3）笔者通过对慢性HBV感染急性发作患者的多点跟踪,观察到这群细胞向IFNγ+细胞分化的现象,说明这群细胞具有可分化性。



综合笔者的发现及其他学者在慢性LCMV感染小鼠模型及肿瘤患者中的发现,可得出以下判断,慢性HBV感染者病毒特异性CD4 T淋巴细胞以TNFα+细胞为主导,该群细胞具有一定的干性,其向IFNγ+细胞的分化则利于患者病毒清除。而慢性HBV感染者病毒特异性CD8 T淋巴细胞是否也是类似情况？笔者认为可能性很大,不过目前并没有相关研究证据。



当然,慢性HBV感染者中也有耗竭的T淋巴细胞,该群细胞细胞因子谱根据当前对T淋巴细胞耗竭的研究来判断应该为TNFα－IFNγ+［14-15,25］,从笔者的研究数据来看,该群细胞在患者中并不占主导。前人研究把HBV特异性IFNγ+ T淋巴细胞数量提升归因于耗竭T淋巴细胞的功能修复,目前看来,这群细胞数量提升很大部分可能来自于TNFα+细胞的分化。





3  慢性HBV感染中病毒特异性T淋巴细胞未能进一步分化的可能原因



慢性HBV感染病毒特异性分化早期的TNFα+ T淋巴细胞为何没有进一步分化,反而处于静息沉默状态？笔者认为原因可能在于天然免疫系统。与EB病毒、巨细胞病毒、HCV等在感染初期即出现病毒快速扩增、天然免疫的迅速激活不同,HBV难以激发天然免疫模式识别受体,表现为天然免疫难以识别的“隐形病毒”［28-29］。而对于慢性HBV感染急性发作患者的研究发现,在发病早期,肝脏炎症反应以天然免疫活化为主。检测不到HBV特异性IFNγ+ T淋巴细胞应答,这说明患者天然免疫系统即使活化了,也主要参与介导肝脏炎症损伤,很难有效激发HBV特异性T淋巴细胞应答以清除病毒［30］。体外刺激HBV特异性CD4 T淋巴细胞上OX40分子（抗原递呈细胞上共刺激分子OX40L的配体）、同时阻断PD-1分子,能显著提升HBV特异性 IFNγ+及IL-21+ CD4 T淋巴细胞的数量,这提示给予适当的天然免疫信号刺激,能有效诱导HBV特异性CD4 T淋巴细胞的进一步分化［31］。





4 展望



慢性HBV感染者T淋巴细胞到底是耗竭的T淋巴细胞主导,还是处于分化早期具有一定干性的沉默T淋巴细胞主导？弄清这个问题非常重要,这直接关系到感染免疫研究方向及临床治疗策略的选择。如果是前者,那么就应该进一步研究HBV特异性T淋巴细胞耗竭的机制,临床免疫治疗策略应聚焦于耗竭T淋巴细胞的功能逆转；如果是后者,那么就应该深入研究处于分化早期的沉默T淋巴细胞进一步分化的机制,临床免疫治疗策略则应聚焦于促进该群T淋巴细胞进一步向清除病毒方向分化。随着目前研究手段的日益精进（单细胞测序、质谱流式等高内涵平台的应用）、研究内容的日益深入,相信这个问题在不久的将来能得到更令人信服的答案。





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引证本文：王昊亮, 邓国宏. 慢性HBV感染者病毒特异性T淋巴细胞：耗竭还是沉默？[J]. 临床肝胆病杂志, 2020, 36(5): 980-982.

本文编辑：朱晶
公众号编辑：邢翔宇










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